【產(chǎn)品名稱】
商品名稱:新城疫中強毒株(NDV-M)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
Name:Newcast Deaseace Virus Mesogenic and Virulent Strains Detection Kit (Real-Time RT-PCR Method)
【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒
【預期用途】
新城疫是由新城疫病毒(New castle disease viurs, NDV)引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病。ND 常呈敗血癥經(jīng)過,以呼吸困難、神經(jīng)機能紊亂、粘模和漿膜出血等為主要特征[1]。根據(jù)病毒株致病力的差異,將 NDV 分為強毒力型、中等毒力型及弱毒力型。NDV 中強毒株在雞群中傳播迅速,危害嚴重;而弱毒株僅引起雞群呼吸道感染和產(chǎn)蛋量下降,多與其它疾病共同發(fā)病而造成一定的危害[1-3]。
本試劑盒適用于檢測的禽類動物肺、脾、腦等組織、呼吸道分泌物、全血等標本中新城疫中強毒株,適用于新城疫中強毒感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒對新城疫中強毒 F 基因裂解位點設計特異性引物和探針[1-2],用一步法熒光 RT-PCR 技術對新城疫中強毒進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
NDV-M 反應液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
NDV-M 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺禽,取肺、脾、腦等組織;待檢活禽,用棉拭子取呼吸道分泌物,放于 1mL50%甘油生理鹽水中;用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h;若需長期保存,應放置-70℃以下保存,凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1.樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;全血樣品待血凝后取血清 100μL,置于 1.5mL 離心管中。
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進行核酸提取, 請按照試劑說明書進行操作。
2.試劑配制(試劑準備區(qū))
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿
7 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:
試劑NDV-M 反應液酶液
用量19μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,20μL /管。
3.加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。
4.PCR 擴增(核酸擴增區(qū))
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi);
4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;熒光通道選擇:檢測通道(ReporterDye)FAM,淬滅通道
(QuencherDye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置:
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle50℃10min否
21 cycle95℃2min否
345 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設定(請參照各儀器使用說明書進行設置,以分析 ABI7500 儀器為例)
反應結(jié)束后自動保存結(jié)果,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整,Start 值可設在 3~15、End 值可設在 5~20,使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期,陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線),點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線; 陰性:樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品:無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示;
陽性質(zhì)控品:擴增曲線有明顯指數(shù)增長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。
6.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關;
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;
3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,會導致假陽性結(jié)果;
4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結(jié)果;
5.不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結(jié)果;
6.試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果;
7.本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行;
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,完-全混勻并短暫離心;
3.反應液應避光保存;
4.反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]曹軍平,胡新崗,吳雙,等.熒光定量 RT-PCR 檢測中、強毒力新城疫病毒方法的建立及驗證.中國動物檢疫,2012. [2]遼寧質(zhì)量監(jiān)督局.DB21/T2465-2015 新城疫強弱毒株 RT-PCR 鑒別診斷技術[S].
[3] Kant A G, Koch D J. Differentiation of virulent and non-virulent strains of NDV within 24 hours by PCR [J].AvianPathol,1997,26:837-849.
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